Ajánlj témát!

Miről szeretnél olvasni nálunk? Ha nem árulod el, csak találgatunk. Írjatok arról, hogy...

Kik vagyunk mi?

Az Akciós Potenciál egy agykutatással illetve más biológiai témákkal foglalkozó fiatalokból álló baráti, munkatársi közösség. Azért indítottuk a blogot, hogy az általunk űzött tudományágak új eredményeit közérthető módon, érdekesen mutassuk be az érdeklődöknek. Nem törekszünk tudományos igényű részletességre, de nem is elégszünk meg annyival, hogy "brit tudósok kimutatták..."

Utolsó kommentek

Szerzők

RSS feed

Rovatok

Címkék

creative commons

Creative Commons License
Terjeszd, használd, hivatkozd

Egyéb

Kémiai Nobel-díj - 2008

Gyakran modják (főleg persze biológusok), hogy létezik egy orvosi és egy biológiai Nobel-díj - csak a biológiait történetesen kémiainak hívják. A Nobel-díjról döntő bizottság a tavalyi évvel ellentétben idén nem cáfolt rá erre az aforizmára, és a zöld fluoreszcens fehérje (green fluorescent protein, GFP) felfedezéséért, felhasználásáért és fejlesztéséért megosztva Osamu Shimomurának, Martin Chalfienek és Roger Y. Tsiennek adta a 2008-as kémiai Nobel-díjat. Ennek apropóján bemutatjuk nektek, hogyan vált a Csendes-óceáni medúzák világító fehérjéje napjaink biológiai kutatásainak elengedhetetlen kellékévé.

 

A sztori tehát a Csendes-óceán, pontosabban a hangulatos nevű Friday Harbor nevű kisváros partján kezdődött 1961-ben, ahova a Princeton Egyetem fiatal japán kutatója, Osamu Shimomura azért érkezett, hogy mintát gyűjthessen az Aequorea victoria nevű medúzából. Ez a medúza azért volt számára érdekes, mert ismert volt róla, hogy zölden világít, és Shimomura, aki a biolumineszcens fehérjék iránt érdeklődött, meg akarta tudni, milyen fehérje áll ennek hátterében. A sikeres mintagyűjtést és néhány további hónapnyi munkát követően sikeresen azonosította is a medúza fő fényforrását jelentő fehérjét, az aequorint. Ez a fehérje azonban meglepetésre nem zöld, hanem kék fénnyel világított, dacára annak, hogy a medúza vizsgált része egyértelműen zöld volt. Viszont megvolt az a tulajdonsága, hogy ezt a Ca2+ ion koncentráció függvényében tette, ezért a következő években Shimomura egy erre a fehérjére alapuló Ca2+ szenzort igyekezett fejleszteni. Bár már az első publikációjukban megemlítik, hogy egy másik, zölden fluoreszkáló fehérjét is azonosítottak az extraktumokból, mégis éveknek kellett eltelnie, hogy Shimomura figyelme efelé a fehérjé felé forduljon. Ezt a zölden fluoreszkáló későbbi sztárfehérjét, a GFP-t csak a '70-es években vette górcső alá, amikor is azonosította benne a fluoreszcenciáért felelős csoportot, az úgynevezett kromofórt.

 

A GFP fehérje szerkezete középen a fluoreszcenciáért felelős kromofór csoporttal.

 

Itt egy rövid kitérő erejéig el kell hogy mondjuk, minek is köszönhető maga a fluoreszcencia. A fluoreszcencia egy olyan folyamat, aminek során bizonyos molekulák adott energiájú fényt nyelnek el, ennek következtében valamilyen nagyobb energiájú állapotba kerülnek, majd bizonyos idő alatt relaxálódnak, visszaállnak a nyugalmi helyzetükbe és eközben a felvett energia egy részét fénykibocsátás formájában leadják. Mivel azonban az energia egy része a folyamat során elveszik (disszipálódik), a kibocsátott fény kisebb energiájú, vagyis nagyobb hullámhosszú lesz, mint a gerjesztő fény. Ehhez a jelenséghez szükségünk van egy olyan molekulára, ami viszonylag könnyen átbillenthető egy magasabb energiájú állapotba. Az ilyen molekulákat hívjuk kromofóroknak. A GFP esetében ez egy para-hidroxibenzilidén-imidazolinon csoport, ami a fehérje három egymás melletti aminosav oldalláncából, egy szerinből, egy tirozinból és egy glicinből alakul ki a fehérje érése során. Az így létrejött kromofór azután képes arra, hogy az aequorin által kibocsátott kék fényt elnyelje, és helyette zöld fényt sugározzon ki. Érdekes módon egyébként a kromofór sokkal jobban gerjeszthető UV fénnyel, mint kék fénnyel, ez az oka annak, hogy a gyakorlatban ma inkább az UV fénnyel történő gerjesztést alkalmazzák a medúza eredeti kék fényű gerjesztése helyett (a medúzában ugyanis az aequorin által kibocsátott kék fény gerjeszti a végül zöld színt adó GFP-t).

A GFP fehérje kromofórjának gerjesztési (folytonos vonal) és kibocsátási (szaggatott vonal) spektruma. Jól látható, hogy a kb. 470 nm-es kék fény csak kevéssé, míg a 400 nm alatti UV fény jelentősen képes gerjeszteni a molekulát. A kibocsátott fény 510 nm körüli, zöld fény.

 

Természetesen nem véletlen, hogy Shimomura kevesebb figyelmet szentelt a GFP-nek. Azok a tulajdonságok ugyanis, amik ma olyan népszerűvé teszik, abban az időben még vagy hátrányosnak tűntek, vagy egyenesen ismeretlenek voltak. Az egyik ilyen tulajdonság az, hogy a GFP fehérje által kibocsátott fény nem függ a fehérje környezetétől. Vagyis nem alkalmazható semmiféle detektálásra, szemben például a Ca2+ ion-érzékeny aequorinnal. A másik tulajdonság, ami mára a fehérje legfőbb előnyévé vált pedig egész egyszerűen értelmezhetetlen volt abban az időben. Akkoriban ugyanis nem létezett még a genetikai módosítás lehetősége, így Shimomuráék nem tudhatták, hogy a GFP fehérjét megfelelő genetikai beavatkozás révén más fehérjékhez lehet kötni, és ami igazán fontos, a GFP nem változtatja meg ezen fehérjék működését, miközben megtartja fluoreszcens tulajdonságát. Vagyis adott fehérjékhez kötve követni tudjuk ezen fehérjék megjelenési helyét és akár esetleges mozgását is szinte bármilyen élőlénybe juttatva be a GFP-t. Ez volt az a döntő lépés, amit az idei Nobel-díj másik díjazottja, Martin Chalfie vitt véghez 1994-ben, amikor a szükséges technikák már rendelkezésre álltak. A Caenorhabditis elegans nevű, tudományos körökben népszerű féreg DNS-ébe vitte be a GFP fehérjét kódoló génszakaszt oly módon, hogy a GFP a β-tubulin fehérjével együtt fejeződött ki. Mivel a β-tubulin legnagyobb mennyiségben a tapintást érzékelő receptorokban található, a GFP is itt jelent meg, zölden kirajzolva a Caenorhabditis elegans 6 ilyen érzékelő sejtjét.

 

A Caenorhabditis elegans féregbe beültetett GFP fehérjék megvilágítják a β-tubulin fehérjéket, elsősorban pedig az ALMR és PLMR , tapintást érzékelő sejteket (a másik 4 ilyen sejt nem látszik a képen).

 

Ez volt az az áttörés, ami valójában megalapozta a GFP térhódítását. Lehetővé vált ugyanis kiválasztott fehérjék specifikus vizualizációja és monitorozása a hozzájuk kapcsolt GFP jelzőbólyák révén. Meglepő módon azonban még ekkor sem volt ismert, hogyan válik a GFP fluoreszcenssé. A fehérjéket felépítő aminosavak ugyanis fluoreszcensen inaktív vagy csak kevéssé aktív molekulák. A már Shimomura által is leírt, erősen aktív kromofór csoport kialakításához pedig az általános vélekedés szerint szükség lenne valamilyen, a folyamatot katalizáló enzimre. Az a tény azonban, hogy a GFP minden vizsgált organizmusban (melyek természetszerűleg különböző enzimekkel vannak felszerelve) működött, arra utalt, hogy nem enzim-katalizált reakcióban keletkezik az aktív forma. Erre a reakcióra adott magyarázatot még szintén 1994-ben Roger Tsien, aki leírta a molekuláris oxigén által megvalósított kromofór képződést a fehérje szerin, tirozin és glicin aminosav oldalláncaiból.

A GFP fehérje fluoreszcens kromofórjának keletkezése a szerin, tirozin és glicin aminosav oldalláncakból.

 

Azonban még a mechanizmus tisztázásánál is jelentősebb hozzájárulása volt a fluoreszcens fehérjék elterjedéséhez az, hogy a GFP fehérjében létrehozott pontmutációk segítségével más kromofórok kialakulását váltotta ki, amelyek természetesen más színű fényt bocsátottak ki. Lehetővé vált ugyanis így az, hogy több különböző fehérjét lehessen egymás mellett nyomon követni azáltal, hogy más-más fluoreszcens fehérjét kapcsolnak hozzájuk. Ma már több tucat különböző színű nyomjelző fehérje kapható a kereskedelmi forgalomban és a számuk napról napra növekszik.

Néhány módosított GFP fehérje kromofórja: kék (BFP), cián (CFP), erősebb zöld (EGFP) és sárga (YFP) fényt kibocsátó változatok.

 

Összefoglalva tehát ezek a felfedezések egy olyan új eszközt adtak a kutatók kezébe, amivel addig láthatatlan folyamatokat lehet vizuálisan észlelhetővé tenni. Lehetséges például a rákos sejtek kialakulásának és burjánzásának követése, az idegrendszer megbetegedéseinek vizsgálata, vagy akár olyan, az impresszionista festményeket meghazudtoló szépségű képek készítése, amelyekről már korábban beszámoltunk.

 

Brainbow technikával megfestett idegsejtek. A módszer a különböző színű fluoreszcens fehérjék véletlenszerű kombinálásán alapszik.

Nem lenne azonban teljes a kép, ha nem tennénk hozzá, hogy máris feltűnt a színen a GFP és társainak egy komoly kihívója. Ugyan a fluoreszcens nyomjelző fehérjék piaca még mindig felszállóágban van, a jövőben bizonyos területeken könnyen kiszoríthatják őket az úgynevezett kvantum pöttyök (quantum dots), melyek szintetikus úton állíthatóak elő, jóval erősebb fényt adnak és színük sokkal könnyebben variálható.

2008.10.08. 22:42 | psychenova | 17 komment

Címkék: nobel díj c.elegans mikroszkópia gfp brainbow imaging technikák kromofór quantum dot

A bejegyzés trackback címe:

http://akciospotencial.blog.hu/api/trackback/id/tr84703688

Kommentek:

A hozzászólások a vonatkozó jogszabályok  értelmében felhasználói tartalomnak minősülnek, értük a szolgáltatás technikai  üzemeltetője semmilyen felelősséget nem vállal, azokat nem ellenőrzi. Kifogás esetén forduljon a blog szerkesztőjéhez. Részletek a  Felhasználási feltételekben.

Ariel 2008.10.09. 12:50:51

A Svéd Királyi Tudományos Akadémia indoklásában a GFP alkalmazásaként kiemeli az idegsejtek károsodásának nyomonkövetését Alzheimer-kóros betegekben. Feltételezem, hogy valamely, Alzheimer kórra "specifikus" fehérjét címkéztek fel fluoreszcens fehérjével. Mekkorák ezek a marker-fehérjék? Hogyan lehet/szokták eldönteni azt, hogy méretük nem befolyásolja a vizsgálandó folyamatokat? Az alternatív marker-eszköz, a "quantum dots" mekkora, színét hogyan variálják?

psychenova · http://akciospotencial.blog.hu 2008.10.09. 14:38:45

Az, hogy a GFP hozzácsatolása a vizsgált fehérjéhez nem változtatja meg annak működését, természetesen némileg eufemizmus. A gyakorlatban ez inkább azt jelenti, hogy kevéssé szól bele ezekbe a folyamatokba. Persze vannak esetek, amikor jelentékenyebb hatása van, ilyenkor nyilvánvalóan nem (vagy csak megszorításokkal) alkalmazható a módszer. Hogy milyen mértékben befolyásolja a GFP kapcsolás a fehérje működését, azt általában a vizsgált fehérje valamilyen funkcionális paraméterének meghatározásával döntik el. Például ha egy ioncsatornához kapcsolják, akkor megnézik, hogy az ioncsatorna kinetikai paraméterei hasonlóak-e a vad típusú csatorna paramétereivel.
A GFP maga egy 238 aminosavból álló, 26.9 kDa tömegű, és hosszanti tengelye mentén kb. 40 A hosszúságú molekula. A quantum dot-ok ennél némiképp nagyobbak, 150-200 A átmérőjűek. A színüket meglehetősen egyszerű variálni, ugyanis a méretükkel változik, hogy mekkora energiát nyelnek el, és így az is, hogy végül milyen hullámhosszúságú fényt adnak le. A kisebb quantum dot-ok a spektrum kék, a nagyobbak a vörös vége felé tolódnak el.

psychenova · http://akciospotencial.blog.hu 2008.10.09. 16:22:37

Az esetleg idetévedő kockáknak egy apró adalék az idei Nobel-díjasokhoz: Osamu Shimomura fia, Tsutomu Shimomura volt az, aki John Markoff újságíróval együtt elkapta a legendás hackert, Kevin Mitnicket. Kicsi a világ.
en.wikipedia.org/wiki/Tsutomu_Shimomura

kfgyk 2008.10.10. 16:30:08

es mitnicknek azota zold a haja mint jokernek.

feljebb azt irod, hogy a GFP a aequorin altal kiadott fenyt hasznositja tehat a GFP egyedul nem kepes fluoreszcenciara? GFP jelzobolyak telepitesenel hogyan oldjak meg a nekik szukseges inputot (aequorin)?

psychenova · http://akciospotencial.blog.hu 2008.10.10. 17:36:40

Ha Mitnicknek nem is, de néhány más élőlénynek azóta zöld lett a bundája. A legismertebb talán Alba, a nyúl, aki Eduardo Kac, brazil kortárs művész projektje keretében tett szert egy kis GFP-re.
www.elisidman.com/nature_of_neptune/2008/01/alba-the-fluore.html

Ami a GFP-t és az aequorint illeti: ezek, bár mindketten fényt bocsátanak ki, vagyis lumineszkálnak, ezt eltérő módszerrel teszik. Ahhoz, hogy egy molekula fényt bocsáthasson ki, természetesen valahonnan elő kell teremtenie az ehhez szükséges energiát. A GFP ezt egy másik, nagyobb energiájú fotonból fedezi, vagyis fluoreszkál (ez per definicionem azt jelenti, hogy fotont nyel el, majd egy kisebb energiájú fotont ad le). Az aequorin egy másik forrásból nyeri az energiát. Ca2+ iont köt meg, ennek hatására a konfomációja megváltozik, nagyobb energiájú állapotba kerül, majd relaxálódik, visszaáll az eredeti állapotba, és közben fényt bocsát ki. Tehát az aequorin sem a semmiből nyeri az energiát, csak épp nem fényre van szüksége hozzá, hanem Ca2+ ionokra.

A GFP detektálásakor UV fénnyel világítják meg a mintát, így váltják ki a fluoreszcenciát. Az ugyanis, hogy a gerjesztőfény honnan jön, a GFP számára édes mindegy. Sőt, a mesterségesen rásugárzott UV fény még hatékonyabb is, mint az aequorin által kibocsátott kék, ahogy az a postban szereplő spektrumon is látszik.

Ariel 2008.10.11. 10:30:17

A legfiatalabb kémiai Nobel díjas Dick (Roger) Tsien, nem csupán a fehérje-kölcsönhatások, hanem a "kalcium szignál" meghatározásában is maradandót alkotott.

A Dick Tsien által először alkalmazott kalcium indikátorok olyan kisméretű, fényelnyelésre alkalmas egységeket, úgynevezett kromofórokot tartalmazó szerves molekulák, amelyek kölcsönhatásba lépnek a kalcium ionnal, és így a kromofórjaik által elnyelt fény hatására kibocsájtott fluoreszcencens energiájuk intenzitása (és hullámhossza) megváltozik.

Tegyük fel, hogy a vizsgálatunk tárgya egy fehérje és a calcium ion közötti kölcsönhatás mechanizmusának a tanulmányozása, melyik jelzést választanád?

bubuka_visszater (törölt) · http://facepalm.freeblog.hu/ 2008.10.19. 20:31:07

láma kérdés: miért kell a medúzánknak kétlépcsős világítástechnika, miért nem jó a kék fény?

psychenova · http://akciospotencial.blog.hu 2008.10.19. 21:21:46

Ez nekem is eszembe jutott, de sajnos nem tudtam rájönni, mi lehet az oka. Bár a zöld valószínűleg jobban látszik a tengerben, mint a kék. Az pedig, hogy miért nem zöld fényt állít elő egyből, kemilumineszcenciás úton, az talán csak azért van, mert nem jelent még meg olyan mutáció, aminek révén ezt meg tudná tenni.

kfgyk 2008.10.29. 16:56:07

"valószínűleg jobban látszik a tengerben, mint a kék"

mert a tenger is kek? :) amugy igaz, a zold hullamhossza (490 – 575 nm) nagyobb a keknel (420 – 490 nm) raadasul ha kieg a zold meg mindig uzemelhet a tartalek keken.

bs 2008.10.30. 18:01:39

hmm. nem is rossz ötlet, de a kétlépcsős működés arra enged következtetni h az egylépcsős elődnek kék pilácsa volt. Meg kéne nézni a víz elnyelőképességét hullámhossz függvényében.
basszus, mennyi kutatnivaló van még egy nyomorult kis medúzában is :))

SirMook · http://akciospotencial.blog.hu 2008.10.30. 23:31:53

Valószínűleg lehet tudni a víz hullámhosszonkénti elnyelőképességét, csak utána kéne nézni, de ha jól emléxem a középiskolai biosz anyagban volt vmi olyan, hogy a különböző színű fotoszintetizáló moszatok rétegződése a fény vizen való áthatolásával van összefüggésben és legmélyebben a vörösmoszatok lakoznak. De lehet, rosszul emlékszem :)

psychenova · http://akciospotencial.blog.hu 2008.10.31. 16:36:37

Szerintem nem nagyon különbözik a víz fényelnyelése a két tartományban. Legalábbis a tiszta víznek csak a vörös tartományban van nagyobb abszorpciója (ettől kék). Persze lehet, hogy a tengervízben a sótartalom vagy az élőlények miatt ez kicsit eltér, de szerintem valószínűbb, hogy azért előnyösebb a zöld, mert a tenger kékje miatt a kék fény kevésbé feltűnő.

Az viszont nem olyan biztos, hogy az aequorinnak eredetileg is az volt a funkciója, hogy kéken világítson, vagyis valamiféle tartalékrendszer lenne. Lehet, hogy valami egész más szerepe volt, csak mellesleg kék fényt is kibocsátott. Amit aztán később kihasznált az újonnan megjelenő GFP.

kfgyk 2008.10.31. 19:19:40

inkabb ugy mondanam, hogy a kek tartomanyban nagy a szorasa, attol kek (Rayleigh-szórás; ettol kek az eg, a pillangok szarnya, madarak tolla, a ho es a szemem is :) kikerestem a szinek lathatosagat viz alatt: www.underwaterphotography.com/Underwater-Video/Images/EffectsOfDepth.GIF itt latszik, hogy a kek jut legtovabb. A kek hatter ellenere, vizben nem a kek a rejtoszin, hanem a piros, ami mar 6m utan eltunik. Meg az is lehet, hogy jo volt az eredeti fenyrendszer de jott egy parazita GFP es ratelepult. Amugy a kek utan a zold a kovetkezo a lathatosagi skalan, lehet masert volt elonytelen a kek, vagy esetleg mas az intenzitasa. uff.

psychenova · http://akciospotencial.blog.hu 2008.10.31. 20:12:26

Az csakugyan lehet, hogy a Rayleigh-szórás is komoly szerepet játszik abban, hogy kék a tenger, sőt, az is lehet, hogy ez a fontosabb ok, de az, hogy a kék színt nyeli el legjobban a tengervíz, az még korántsem jelenti azt, hogy ez lenne a legalkalmasabb jelzőfénynek, vagy hogy a piros lenne a jó rejtőszín. A kellőképpen feltűnő- és a jó rejtőszín elsődleges ismérve a háttértől való elkülönülés, illetve az ahhoz való hasonlóság. Egy fehér háttér előtt például épp a fény teljes elnyelése, vagyis a fekete szín lehet a legfeltűnőbb.

Ez a polip például a legkevésbé sem piros, de valószínűleg kevesen bukkannának rá a videón az első 10 másodpercben:
www.youtube.com/watch?v=ckP8msIgMYE

Egy érdekes írás a Critical Biomass-ről a tengeri álcázás bajnokairól: criticalbiomass.freeblog.hu/archives/2007/06/12/Az_alcazas_mesterei/

a.zsuzsi 2008.11.16. 14:43:27

hat ezek a dolgok CSODALATOSAK!!!!!

MAILMAN#32 2009.01.20. 15:47:50

Csak halkan jegyezném meg, hogy nem Dick (Roger) Tsien a legfiatalabb kémiai Nobel-díjas... A 2002-es díjazott(ak egyike), Koichi Tanaka pl. 43 éves mivolt, mikor elnyerte az elismerést...

MAILMAN#32 2009.01.20. 16:00:43

Csak halkan jegyezném meg, hogy nem Dick (Roger) Tsien a legfiatalabb kémiai Nobel-díjas. Az egyik 2002-es díjazott, Koichi Tanaka pl. csak 43 éves volt, mikor elnyerte az elismerést...